季鹏飞课题组ACS Catalysis: 利用人工智能算法设计超耐热、耐有机溶剂的羰基还原酶
论文Designing γ-Carbonic Anhydrase as a Broad-Scope Metalloreductase with Ultrathermostability and Organic-Solvent Tolerance于2025年4月30日正式在ACS Catalysis上线。本研究利用基于深度学习的蛋白质序列设计算法ProteinMPNN结合进化信息，对γ-碳酸酐酶（γ-CA）进行设计改造，成功将其开发为一种广谱金属还原酶。与野生型酶相比，设计出的变体催化活性显著提升，并通过定向进化进一步优化，获得了对酮类和烯烃不对称还原的高催化活性和优异对映选择性。值得注意的是，改造后的γ-CA展现出超高热稳定性（熔解温度达96℃）和有机溶剂耐受性（可耐受50%极性有机溶剂）。通过蛋白质晶体学、分子动力学模拟和QM/MM计算等机理研究表明，L83A突变体的优势在于形成了末端锌氢中间体的反应路径。该研究展示了深度学习蛋白质设计与传统工程方法相结合在构建高效稳定生物催化剂方面的潜力，不仅为γ-CA的优化提供了框架，也为开发极端条件下高稳定性和高活性酶提供了一种可推广的策略，具有潜在的工业应用前景。
作者以γ-碳酸酐酶Cam为起点，锁定了锌离子活性中心10个关键残基，并基于consurf数据库的同源序列分析，制定了四种设计策略：除固定活性位点外，分别额外固定保守性前30%、50%和70%的残基。利用ProteinMPNN的同源寡聚模式设计出180个变体，通过AlphaFold预测证实这些变体均保持优异的结构稳定性（pLDDT>95.5，骨架RMSD<0.7Å），从中按比例选取20个代表序列（标记为dGCA）进行实验验证（图1）。该设计策略特别注重维持三聚体界面相互作用，为后续催化性能优化奠定了基础。用全细胞验证了20个ProteinMPNN设计的变体的还原活性。在苯乙酮还原中，dGCA15表现出最高活性（99%产率，S型），而dGCA9具有最佳对映选择性（86% ee，R型）。底物通道的L83A突变能显著提升催化性能，其中dGCA1A对苯乙酮的产率和ee值分别达99%和97%。该变体的大活性空腔（1007.75ų）可容纳并高效催化大位阻底物CPMK的还原，经优化获得的dGCA1AT变体实现>99%产率和84% ee。特别值得注意的是，dGCA1A首次实现了锌酶催化的烯烃不对称还原（1-硝基-2-苯基丙烯，84%产率，93% ee）。动力学分析显示dGCA1A的kcat值比野生型提高746倍，催化效率提升5170倍。晶体结构证实L83A突变扩大了底物通道，同时保留了关键活性位点。40个突变使净电荷降低，并新增氢键和盐桥，显著提升了酶的热稳定性和有机溶剂耐受性（图1）。
图1
作者通过多种方法评估了dGCA1A的热稳定性。圆二色谱分析显示该酶在80℃加热后二级结构基本保持完整，且冷却后信号恢复。dGCA1A的Tm达96.1℃，较野生型（67.8℃）显著提高。在95℃加热60分钟后，酶溶液仍保留75%以上的蛋白浓度，且催化半衰期达298分钟。温度活性测试表明其TOF在90℃时较25℃提升24倍。分子动力学模拟显示，95℃下蛋白骨架RMSD稳定在2.0Å，氢键数量保持330个，活性位点α螺旋比例维持在81%；而120℃时结构稳定性显著下降，α螺旋比例降至52%，氢键减少至300个。这些结果证实dGCA1A具有优异的热稳定性，同时揭示了其在更高温度下的变性机制（图2）。
图2
作者又评估了dGCA1A在有机溶剂中的稳定性与催化性能。实验显示，在50% DMSO、乙腈和1,4-二氧六环中，dGCA1A能保持77-96%的催化产率及90-98%的对映选择性。值得注意的是，对于1-萘醌和2-乙酰萘酮等疏水性底物，dGCA1A在20% 1,4-二氧六环中的催化活性和对映选择性反而优于纯水相，产率分别提升至31%和85%。圆二色谱分析证实，20% 1,4-二氧六环中dGCA1A的二级结构保持完整，而野生型则发生明显改变。这些结果表明dGCA1A不仅具有优异的有机溶剂耐受性，对某些反应甚至表现出有机溶剂偏好性，为非水相催化应用提供了可能（图3）。
图3
作者进一步探索了dGCA1A的底物适用范围。该酶能高效催化多种芳基-烷基酮的不对称还原，包括各类苯乙酮衍生物，杂芳基酮和氟甲基酮。该酶还能实现更具挑战性的二烷基酮并实现二酮化合物的区域选择性还原。对于二芳基酮的还原，M135T和M135L的引入，分别将CPMK和2,4'-二氯二苯甲酮的ee值提升至84%和88%。此外，dGCA1A对多种硝基烯烃表现出优异的对映选择性（94-99%ee），包括杂环底物和难还原的二烷基硝基烯烃。这些结果表明dGCA1A具有广泛的底物适用性和优异的立体选择性（图4）。
图4
最后作者通过计算模拟和实验验证揭示了dGCA1A的催化机制。分子动力学模拟和QM/MM计算表明，反应通过锌氢中间体进行：苯基硅烷与锌羟基发生阴离子交换形成锌氢物种（能垒16.6 kcal/mol），随后氢负离子转移到酮的si面生成R构型产物（能垒9.4 kcal/mol）。实验证实，更换不同硅烷不影响产物ee值，支持了锌氢中间体机制。关键残基Glu62的丙氨酸突变显著降低对映选择性，验证了其通过水分子与底物形成氢键的作用。综合结果表明，dGCA1A遵循锌氢插入机制，即氢负离子先由硅烷转移至锌，再转移至酮基底物（图5）。
图5
总之，本研究通过深度学习设计获得广域催化活性、极高热稳定性和有机溶剂耐受性的γ-CA变体，为生物催化剂开发提供了新策略。
浙江大学季鹏飞研究员、宁波大学张璇副研究员为本文的通讯作者，浙江大学硕士生鲍逸娴，博士生李云昊和中山大学硕士生谢哲楷为本文共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项资金、宁波市甬江人才计划等项目的资助，得到浙江大学、浙江大学化学系、浙江大学催化研究所的大力支持。
文字：季鹏飞研究员课题组
编辑：黄珍珍、邹尔纯
审核：林旭锋