季鹏飞课题组JACS：从5个催化基团创造新酶：微型高效金属酮还原酶的从头设计

论文De Novo Design of Miniature and Efficient Metallo-Ketoreductases于2026年5月20日正式在Journal of the American Chemical Society上线。本研究利用深度学习引导的工作流程，从理论活性位点出发从头设计金属酮还原酶，实现了非生物氢负离子转移机制对酮的不对称还原。设计的微型酶仅含130个氨基酸（13.8 kDa），展现出优异的催化性能：k_cat/k_uncat高达1.4×10⁶，转化数（TON）最高达19,000，对映体过量（e.e.）值最高为98%，并具有广泛的底物谱和区域选择性。值得一提的是，该酶对90°C高温处理表现出卓越的热稳定性，并耐受多种有机溶剂，优于天然混杂还原酶。该工作展示了从头设计非天然催化功能的强大能力，为不对称合成提供了一种可规模化、可持续的定制化生物催化剂。

图1 计算设计策略与初步筛选

这项研究以天然人源碳酸酐酶II（260个氨基酸）的理论活性位点为蓝本，围绕Zn²⁺配位残基His94/His96/His119、负责静电稳定和活化Zn结合水的Glu106，以及形成氧阴离子空穴的Thr199，设计更小、更稳定的人工金属酮还原酶。基于hCAII–锌氢化物–苯乙酮复合物的QM/MM模型，研究团队利用RFDiffusionAA生成了8,000个长度小于155个残基的de novo α/β混合骨架，并结合ProteinMPNN、AlphaFold2、RIFDock、Metal3D和Rosetta等算法进行多轮序列与活性位点优化。最终获得91个高质量设计，聚类为7个家族，并选取其中52个代表性设计体进行实验验证。全细胞催化实验表明，多数设计体能够催化苯乙酮不对称还原，并呈现明确的对映选择性。最优设计体dMKR产率最高可达98%，e.e.达97%；另有设计体则偏向生成相反构型的产物。实验结果与设计模型预设的立体化学偏好高度一致，说明该流程不仅能够构建高效的人工金属酮还原酶，还能够在设计阶段预先编码并实现特定的立体选择性（图1）。

图2 热稳定性和有机溶剂耐受性

dMKR在圆二色谱中显示α/β结构在25-80°C下保持稳定，熔解温度T_m高达94°C，显著高于天然hCAII的59°C。在60°C加热处理5小时后，dMKR仍保持96%产率和94% e.e.；在90°C加热处理60 min后，仍维持95%产率和91% e.e.，而hCAII在90℃加热2 min后完全失活。利用这一高热稳定性，可以通过80°C加热湿菌裂解液10 min来一步纯化酶。在30%（v/v）1,4-二氧六环、DMSO、DMF、异丙醇、乙醇、正己烷等有机共溶剂中，dMKR的产率和e.e.均保持优异，尤其在DMSO中产率>99%，e.e. 98%，表现出显著的溶剂耐受性（图2）。

氘代标记实验确认氢负离子来源于硅烷而并非溶剂。不同种类硅烷催化保持相同e.e.值，支持锌氢中间体机制而非硅烷直接插入。丙氨酸扫描突变实验显示，与锌配位的残基His42/His44/His61突变后酶几乎完全失活，Glu54突变会降低活性并翻转产物构型，而Thr84突变轻微降低产率但不影响e.e.。Zn²⁺拔除后会使得酶完全失活，重新加入Zn²⁺可恢复活性，测得Zn²⁺与蛋白的K_d为0.87 μM，补充Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺等其他金属离子后仅保留部分活性，上述结果证明dMKR为锌依赖型金属酶，遵循锌氢机制。

图3 定向进化与活性测试

dMKR能高效还原16种芳基酮、杂芳基酮、二烷基酮及环烷基酮，产率高达99%，e.e. >90%。对于高难度二酮底物1-苯基-1,3-丁二酮，dMKR选择性还原苯环邻位羰基，产率85%，e.e. 95%，展示出优异的区域选择性和立体选择性。通过FRISM策略对dMKR进行定向进化，获得变体dMKR_V88A和dMKR_I92L，对四氢萘酮等环状酮的产率和e.e.显著提升，进一步拓展了底物范围（图3）。

本研究通过深度学习方法从头设计出高效微型金属酮还原酶，该酶具有超高热稳定性（T_m =94°C）、有机溶剂耐受性、广泛的底物范围和精确立体及区域选择性。70%（36/52）的测试序列显示出可检测的活性与对映选择性，验证了计算设计的高成功率。该工作为构建非生物金属氢化物机制的氧化还原酶提供了全新范式，在工业生物催化领域具有广阔应用前景。

浙江大学季鹏飞研究员为本文的通讯作者，浙江大学博士生许依玲，博士生李云昊为本文共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金和国家重点研发计划等项目的资助，得到浙江大学、浙江大学化学系、浙江大学催化研究所的大力支持。

季鹏飞：研究方向为酶的理性设计与催化应用。2014年本科毕业于四川大学，2018年获芝加哥大学化学博士学位，导师林文斌教授。2019-2020年在加州大学伯克利分校作为米勒学者从事博士后研究，导师John Hartwig教授，2025年3-8月在华盛顿大学任访问学者，合作导师诺贝尔化学奖得主David Baker教授。2020年12月起任浙江大学 “百人计划”研究员。在自然化学、自然合成、JACS、自然通讯等期刊发表学术论文30余篇，获授权国际专利3项。课题组主页：https://person.zju.edu.cn/jipengfei

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.6c00732

图文：季鹏飞研究员课题组

编辑：黄珍珍 邹尔纯

审核：陆展