吴起教授课题组Angew：工程化改造光敏脱羧酶催化草酸酯动力学拆分反应
手性分子由于其理化特性与手性构型高度相关。因此，选择性制备具有特定立体构型的光学纯分子十分重要。生物催化由于具有催化高效性、底物专一性、高立体选择性等优势而成为了手性不对称合成的重要方法和研究热点。通过蛋白工程，将一种特定酶的立体选择性进行有效调控，实现精准合成(R)或(S)特定构型的光学纯分子是有挑战性的。
近日，吴起课题组利用聚焦理性迭代定点突变 (FRISM) 策略对来源于小球藻的脂肪酸光脱羧酶 (fatty acid photo-decarboxylase from Chlorella variabilis，CvFAP) 进行理性设计，获得了两种具有优异选择性的高度立体互补变体。这些突变体可以用于CvFAP催化的光驱动动力学拆分草酸酯或草氨酸（可用于制备相应的仲醇或胺）（图1），为制备手性仲醇或胺提供了新的生物转化过程，并通过分子动力学模拟、动力学数据和瞬态光谱实验阐明了选择性的来源。
图1. 基于工程化CvFAP酶进行草酸酯的光驱动动力学拆分。
课题组之前的工作（Angew. Chem. Int. Edit.2019, 58, 8474）表明，工程化的 CvFAP 变体可以识别羧酸 α 位的手性中心，产生相应的手性酸产物，然而在远离反应羧酸基团的手性中心是否也能被CvFAP分辨还不清楚。作者最初选择了手性中心位于反应羧酸基团的γ位的2-庚醇草酸酯作为模式底物，测试了野生型CvFAP光催化的草酸酯动力学拆分的可行性，尽管反应产率与选择性欠佳，但初步验证了酶促光驱动草酸酯动力学拆分的可行性。在此基础上，作者选择了一系列烷基草酸酯或N-烷基草酸以测试野生型CvFAP催化的光驱动动力学拆分的底物范围（图2）。野生型CvFAP对2-庚醇草酸酯与2-己醇草酸酯底物表现出中等的活性和立体选择性，然而对其他测试底物的结果极差，催化效果随着烷基草酸酯链长的增加而显著降低。
图2. 野生型CvFAP酶催化光驱动动力学拆分的底物谱。
为改善CvFAP催化草酸酯动力学拆分的性能，作者选择对CvFAP进行定向进化以改善甚至逆转CvFAP对草酸烷基酯的立体选择性。通过“聚焦理性迭代定点突变”（FRISM）策略，作者得以大量减少筛选工作的同时，高效筛目标突变株。基于模型底物与CvFAP的分子对接结果，作者选择了残基V453、A457、G462、Y466、T484、Q486和F469为关键残基，并挑选了具有不同电子特性（E，R）、空间位阻（W，L）和极性（Y，S）的六种氨基酸来扫描CvFAP的关键位置，并成功获得了具有优异选择性和产率的（R）-选择性突变株（A457W/G462N/Q486S）与(S)-选择性突变株（T484S）（图3）。
图3. CvFAP酶的蛋白质工程改造。
作者进一步研究了对映体互补突变体的底物范围，以验证该动力学拆分的普适性（图4）。WNS变体表现出广泛的底物范围，可以接受一系列具有不同链长、不同侧链和不同取代基的仲醇草酸酯，表现出良好的立体选择性和产率，且E值>200。同时，尽管T484S突变体的底物范围比WNS相对窄，但也有很好的拆分效果。由于酰胺键和酯键之间的差异，突变体在这些底物上的表现稍差，但WNS变体仍然取得了令人满意的结果，E值>200。
图4. CvFAP突变株T484S与WNS催化光驱动动力学拆分的底物谱。
最后通过顺态光谱研究辅以分子动力学模拟，作者对各种底物的最佳突变株与相应底物的结合情况进行了研究，并对其选择性产生的分子机制进行了探讨，进一步认识了不同突变株与其最适底物之间的构效关系和选择性机理（图5）。
图5. 不同构型底物在CvFAP催化口袋结合状态的分子动力学模拟与顺态光谱。
本研究以FRISM策略实现了小球藻脂肪酸光脱羧酶（CvFAP）的蛋白质工程改造，并获得两种具有很高选择性的高度立体互补的突变株（ee值均高达99%）。这些CvFAP突变体可用于光驱动的草酸或草胺酸的动力学拆分，为制备手性二级醇或胺提供了一种新的生物转化路线。并以分子动力学模拟、动力学数据和瞬态光谱揭示了选择性的来源。
相关研究成果以“Stereodivergent Protein Engineering of Fatty Acid Photodecarboxylase for Light-Driven Kinetic Resolution of Sec-Alcohol Oxalates”为题发表于Angew. Chem. Int. Ed.。该论文的第一署名单位为浙江大学化学系，吴起团队硕士生牟凯豪为本文第一作者，吴起教授为通讯作者，化学系徐维华博后、杭师大王志国博士为本文共同通讯作者。
论文信息：Stereodivergent Protein Engineering of Fatty Acid Photodecarboxylase for Light-Driven Kinetic Resolution of Sec-Alcohol Oxalates
Kaihao Mou, Yue Guo, Weihua Xu*, Danyang Li, Zhiguo Wang*, Qi Wu*
DOI: 10.1002/anie.202318374
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202318374
文 字：吴起教授课题组
编 辑：黄珍珍、张维娅
审 核：林旭锋
终 审：丁立仲