吴起课题组在脂肪酶定向进化提高立体选择性方面取得进展
来源：浙江大学化学系
发布时间：2013-03-25
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工业生物技术是以可再生生物资源为原料，微生物或酶为催化剂进行物质转化，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。工业生物技术已经形成生物技术革命的第三次浪潮，是工业可持续发展最有希望的技术之一。工业生物技术中的生物催化过程具有一些化学催化方法无可比拟的优点，例如（1）专一性强，具有独特、高效的底物选择性，包括化学选择性、区域选择性和立体选择性；（2）反应条件温和，通常在室温和常压下进行，能源消耗少，反应可控性高；(3) 环境友好，由于减少了保护、脱保护步骤，原材料的消耗和污染物排放将会大大减少。因此，生物催化是绿色化学与绿色化工发展的重要趋势之一。但是作为工业生物技术中关键要素之一的酶催化剂经常难以满足工业生产中对其催化性能和性质的要求，需要加以不断改造。
蛋白质体外定向进化是20世纪90年代末发展起来的一种蛋白质改造新策略，可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下在体外模拟自然进化的过程，它通过对目标蛋白的编码基因进行随机突变和重组，使基因发生大量变异，并定向筛选出所需性质或功能,从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。这种在体外模仿自然进化过程的方法，是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法，已在很短的时间内取得了令人瞩目的成就。
吴起副教授与德国马普学会煤炭化学所著名有机化学家、分子生物学专家Manfred T. Reetz教授合作开展了南极假丝酵母脂肪酶B（Candida Antarctica Lipase B）的定向进化研究，目前取得了重要进展，研究成果作为浙江大学第一作者单位已全文发表在J. Am. Chem. Soc., 2013, 135(5), 1872-1881。
Candida Antarctica Lipase B是当前学术界和工业生产中应用最广泛的脂肪酶，丹麦的诺维信公司是该酶最大的生产厂家。CALB脂肪酶在催化酯化或水解反应中，对醇底物具有非常好的立体选择性，但是对于酸底物的立体选择性很差，而且底物谱比较窄，如何提高CALB对酸的酯化或水解反应立体选择性是一个重要的科学问题。该研究利用采用组合活性位点迭代饱和突变的策略，选择了围绕CALB活性位点的近20个关键残基，通过5轮突变和近1000个突变株的高通量筛选，分别获得了对α-2芳基丙酸的R和S异构体具有高立体选择性的突变株，其中具有S构型选择性的突变株的E因子（S构型）为72，R构型突变株的E因子（R构型）为42。所获得的两类突变株都具有较宽的底物谱，而且对不同底物都体现了类似的高R和S选择性，最高的E>500。另外有趣的是这些对酸底物具有互补选择性的突变株也对醇底物的立体选择性具有互补性。
图1（A）定向进化过程中所获得的各种立体选择性CALB突变株；
（B）R/S底物在相应选择性突变株的催化空腔中不同的结合方式。
本文感谢浙江大学新星计划和国家留学基金的支持。